los medios de cultivo

MEDIOS DE CULTIVO (http://natalymosquera.blogspot.com/)
Los medios de cultivo constituyen un elemento fundamental para el cultivo “in
vitro” de células, tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de
embriones, embrioides, la organogénesis, la micropropagación, etc. Los medios de
cultivo tienen una serie de componentes generales y específicos cuya presencia y
concentración estará en dependencia del objetivo que se persiga en su utilización.
Así, los medios de cultivo pueden ser líquidos o tener un soporte sólido, tienen
sustancias minerales, vitaminas, aminoácidos, azúcares, fitohormonas, etc.
También pueden contener por ejemplo extractos naturales, según su finalidad y
debe quedar claro que no todos llevan un complemento completo de todos los
factores.
(http://fbio.uh.cu/webfv/docencia/tema%205.doc)
En el cultivo in vitro de tejidos vegetales, se denomina solución madre o stock a
cualquier solución de composición elevada y concentración definida, en la que el
soluto puede ser uno o más compuestos químicos de los que conforman un
determinado medio de cultivo y que mediante un proceso de dilución permita la
preparación de 1 litro de medio de cultivo. (Pierik, 1990)
Desde el punto de vista práctico la preparación de soluciones madres o stock tiene
como finalidad evitar:
Pesar cada uno de los compuestos químicos que constituyen un medio de cultivo,
cada vez que se requiera elaborar, lo que implicaría evitar demasiado tiempo en su
preparación.
Inexactitud al pesar cantidades muy pequeñas de ciertos compuestos químicos.
Otro aspecto importante que se debe considerar es la cantidad de agua que se
utilice para disolver las sales inorgánicas que constituyen las soluciones stock y en
general el medio de cultivo.
El agua debe ser destilada o bidestilada y necesariamente des ionizada. (Kyte &
Kleyn, 1996)
Se han creados numeroso medios de cultivos (medio basal), cuyas diferencias
estriban en las cantidades y tipos de sales empleadas.Entre los medios de cultivo
más conocidos se encuentran:
Murashige y Skoog (MS) (1962),
Linsmaier y Skoog (LS) (1965),
Borgin y Nitsch (BN) (1967),
Gamborg (B5) (1970),
Sachs (1860), Knop (1865),
Arnon y hoglan (1940),
Gautheret (1942), Riquer y Duggar (1946),
Heller (1953-58)
Nitsch y Nitsch (1956),
Torrey y Shigemura (1957-64),
White (1963),
Blaydes (1966),
Miller y Oyima (1968).
SALES INORGANICAS
MACRONUTRIENTES
Los elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas.
— Nitrógeno (N): forma parte de aminoácidos, vitaminas, proteínas y ácidos
nucleíco.
— Magnesio (Mg): es parte de la molécula de clorofila y de los ribosomas
.Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de
crecimiento,
— Fosforo (P): Forma parte de las moléculas que almacenan y transfieren la
energía química de los ácidos nucleicos, de este depende la energía celular.
Potasio (K): Desempeña un papel importante en la regulación osmótica y en la
actividad enzimática.
— Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminoácidos
Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halófilas y en plantas cuyos
productos fotosintéticos son C4 y plantas con metabolismo acido. (García, 2000)
Micronutrientes
Estos micronutrientes son importantes en las células vegetales, ya que al
adicionarles ciertas cantidades excesivamente pequeñas permite que las sales
madres sean mas eficaz para el medio de cultivo.
Hierro (Fe): forma el núcleo del citocromo y parte de la ferrodoxina.
Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa
Manganeso (Mn): induce a la síntesis de clorofila, se requiere para la formación
del O2 en la fotosíntesis.
Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristematica,
involucrado en la síntesis de bases nitrogenadas como el uracilo.
Cobre (Cu): permite la oxidación respiratoria final, esta ligado al proceso de
lignificación.
— Zinc (Zn): requerido para la oxidación e hidroxilación de compuestos fenolicos.
— Cobalto (Co): componente de la vitamina B12
— Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolución del O2 en la
fotosíntesis. (García, 2000)
REGULADORES DE CRECIMIENTO
Adicionalmente a los nutrientes, generalmente es necesario agregar una o más
sustancias reguladoras; frecuentemente Auxinas y/o Citoquininas, pero a veces
también Giberelinas o ácido ascórbico, para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro
de tejidos y órganos. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias varían
considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endógenos de estos
reguladores, así como con la finalidad del cultivo in vitro.
El uso de fitoreguladores en los cultivos in vitro es de gran importancia por cuanto
Se ha demostrado que la clase y concentración de dichas sustancias interactúan
con el genoma de la planta. (Montoya, 1991)
Auxinas
Son utilizadas principalmente para la diferenciación de raíces y la inducción de
callo. Las más utilizadas son:
IBA: (ácido indol-3-butírico) = diferenciación de raíces
ANA: (ácido naftalenacético) = diferenciación de raíces
IAA: (ácido indolacético) = Prolongación de explantes
2,4-D: (ácido diclorofenoxiacético) = inducción de callos.
(Las Auxinas se disuelven usualmente en etanol diluido o en una solución de
hidróxido de sodio).
Citoquininas
Promueve la división celular y la inducción de yemas adventicias en callos y
órganos. Brotación.
— Las Citoquininas más usadas son:
— BAP: (bencilamino purina)
— Kinetina
— 2-ip (isopentenil-adenina).
(Generalmente son diluidas con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio).
Giberelinas
Su función principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina
con mayor uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al
calor (pierde el 90% de su actividad después del autoclavado)
Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La
mayoría de los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de
hormonas.
Acido abscísico
El ácido abscísico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo
en los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduración de
embriones, y en cultivos de células en suspensión facilita la sincronización de la
división celular.
Etileno
Interviene en procesos como: liberación de la dormancia, crecimiento y
diferenciación de brotes y raíces, formación de raíces adventicias, abscisión de
hojas, flores y frutos, inducción de floración en algunas plantas, senescencia de
hojas, flores y maduración de frutos.
Vitaminas
La mayor parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero
aparentemente lo hacen en cantidades infraóptimas. Para lograr un buen
crecimiento es necesario a menudo suplir al medio con una o más vitaminas.
La tiamina (B1) es la que más se utiliza y se la considera un ingrediente esencial.
Otras vitaminas también han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento
in vitro, como son: pidiroxina (B6), ácido nicotínico (B3), pantotenato cálcico (B5).
Fuentes de carbono
Normalmente para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos es necesario
adicionar una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro
tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosíntesis o incluso en
oscuridad.
La sacarosa es la más utilizada para propósitos de Micro propagación.
Generalmente se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aquí es
convertida rápidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se
utiliza seguida de la fructosa.
El azúcar blanco refinado que se vende en los supermercados puede resultar
adecuado para la Micropropagación en muchos casos.
Azucares
Los azucares en el medio cumplen dos funciones esenciales:
— Son fuentes de energía.
— Mantienen en el medio un potencial osmótico determinado.
AGENTES GELIFICANTES
Agar: Es una mezcla de polisacáridos extraídos de un alga marina. Tiene una
elevada masa molecular, como también la capacidad de hidratarse y formar una
red. La planta no puede digerirlo ni absorberlo, además no interactúa con los
componentes nutritivos del medio. El Agar se funde a altas temperaturas (1000C),
solidifica alrededor de los 400C y no se degrada con la luz. Generalmente se utiliza
a una concentración de 0,6 - 1%. El principal problema con este gelificante es su
elevado costo.
Gelrita: Es un heteropolisacárido aniónico natural producido por una bacteria, que
forma geles semejantes al Agar. Se puede usar a una concentración de 0,15-
0,30%. Los geles de gelrita son notablemente más claros que los de Agar, y
también cuajan más rápidamente. (García, 2000)
PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN
Protocolo de desinfección para yemas de mora de castilla
1.0.-Introducir hipoclorito al 1%
Detergente.
BAP 2mg.
Tween 20%
Yodo 5ml.
Ácido ascórbico 2mg/l durante 15 minutos.
Enjuagar con agua destilada.
Pasar a cámara.
Sumergir en alcohol al 70% por 2 minutos.
Enjuagar.
Hipoclorito al 3% por 5 minutos.
Enjuagar.
Sembrar.
2. Hipoclorito al 5% por 20 minutos.
Enjuagar.
Alcohol al 70% por 5 minutos.
Enjuagar.
Hipoclorito al 5%
acido ascórbico 2mg/l durante 5 minutos.
Enjuagar.
Tween 20 por 5 minutos.
Enjuagar y sembrar.
Desinfección del explante: brotes de tubérculos, aproximadamente de 2-3 cm de
longitud y de 4-5 nudos/brote.
— Lavar los brotes bajo agua corriente.
— Sumergirlos en una solución de agua lavandina comercial (55 g Cl/l) al 20%
más una o dos gotitas de Tween 20, durante 15 minutos agitando suavemente.
— En cámara de flujo, extraer los brotes y enjuagarlos con agua estéril durante 15
minutos divididos en enjuagues sucesivos de 5’ c/u.
— Colocar los brotes sobre papel de filtro estéril hasta la siembra.
Meristemas de plátano y banano
Alcohol al 70% 5minutos.
Hipoclorito 3% por 10 minutos
Enjuagar en cámara de siembra.
Hipoclorito 1% por 5 minutos en cámara, enjuagar.
· Sembrar.
· Cápsula de orquídeas
· Lavar cápsula con jabón
· Enjuagar.
Sumergir cápsula en hipoclorito 1% con una gota de detergente por 10
minutos.
· Transferir la cápsula a la cámara de siembra.
· Sumergir en alcohol al 100% por tres minutos.
· Enjuagar y sembrar.
·
Bromelias (piña)
·
1ml de fungicida (Benomil) por 15 minutos.
· Alcohol al 25% más ácido ascórbico (2mg/l) por 2 minutos.
· Purseu 25% mas ácido ascórbico (2mg/l) por 2 minutos.
· Alcohol al 25% por 5 minutos.
· Enjuagar y sembrar
· Anturio
Alcohol al 70% por 10 minutos
· Hipoclorito 5% por 20 minutos.
· Enjuagar en cámara (agua estéril).
· Hipoclorito 3 % por 2 minutos enjuagar y sembrar.
·
Rosa y clavel
·
Alcohol 70% por 5 minutos.
· Hipoclorito 3% por 10 minutos.
· Hipoclorito 5% por 10 minutos.
· Enjuagar en cámara (agua estéril).
· Hipoclorito 1% por 3 minutos.
· Enjuagar y sembrar.
·
Estacas de olivo
·
Sumergir las estacas en etanol al 80% a 96ºC por 2-3 segundos.
· Hipoclorito de sodio por 20 minutos. Llévelo al agitador magnético a 37 (1ºC).
· Enjuagar 3 veces con agua destilada estéril.
· Deje secar y siembre.
·
Desinfección de cápsulas de orquídeas
·
— Etanol 70º (5 minutos),
· — Solución de NaOCl al 3,3% más el agregado de dos gotas de Tritón
· — 100â, durante 30 minutos en agitación.
· — Finalmente, las cápsulas fueron sumergidas en etanol y flameadas.
· Desinfección de cápsulas de orquídeas
· Detergente al 1% y sumergidas 5 minutos en solución de hipoclorito de sodio
(NaOCl) al 1 % de cloro activo al que se le añaden dos gotas de Tween 20.
· Lavar con agua destilada estéril.
· En la cabina de flujo laminarse sumergir las cápsulas en solución de sulfato de
cobre al 2% durante cinco minutos
· Hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1 %, y finalmente se enjuagaron con suficiente
agua destilada estéril.
· Antes de ser seccionadas, las cápsulas fueron pasadas por alcohol al 70% y
flameadas.
·
· Explante de cerezo (Prunus avinum) Miller 1982
·
Remojar los explantes en una solución de hipoclorito de sodio al 5% con 0.1%
de tween 20 por 10 minutos.
· Dos enjuagues de 5 minutos cada uno con agua destilada, desionizada o
estéril.
Remoje los explantes en etanol al 70% por 5 minutos
· Enjuague dos veces, cada enjuague por 5 minutos con agua destilada,
desionizada o estéril.
· Kewiña (Polyepis besseri Hieron)
— Hipoclorito de sodio al 2.5%. según el protocolote desinfección desarrollado
por plantas leñosas.
· — Testando diferentes tiempos (15, 20 y 25 minutos).
· — Formol al 37% durante (15, 20 y 25 minutos).
· Especies Proteáceas
— Explantes de 10-15 cms aproximadamente se pusieron en solución de 3 g/L
de:
— captan por 45 minutos.
· — Se sumergen 5 segundos en etanol 70%.
· — Dos enjuagues en agua destilada esterilizada.
· — Se traspasan a hipoclorito de sodio al 1% por 15 minutos la mitad de los
explante y la otra mitad se traspasa a una solución de hipoclorito de sodio al
0,75% por 15 minutos, ambas en constante agitación.
· — Enjuague en agua destilada esterilizada.
· — Se cortan los explantes de 2-3 nudos cada uno, bajo condiciones asépticas.
Nothofagus procera (embriones aislados)
·
— Etanol al 70% v/v durante 3 minutos,
· — Tres enjuagues de 2 minutos cada uno, con agua destilada estéril.
· — Luego las semillas fueron inmersas en una solución de hipoclorito de sodio,
con un 2% de cloro activo durante 20 minutos, para luego realizar tres
enjuagues con agua destilada estéril durante 2 minutos cada uno, todo lo
anterior bajo agitación constante.
Componentes (mg/L)
Medio Base
Gamborg Murashige and
Skoog (MS)
White
Aluminum chloride • 6H2O
Ammonium nitrate 1650
Ammonium phosphate
monobasic
Ammonium sulfate 134
Boric acid 3 6.2 1.5
Calcium chloride anhydrous 113.24 332.2
Calcium nitrate 200
Calcium phosphate tribasic
Cobalt chloride • 6H2O 0.025 0.025
Cupric sulfate • 5H2O 0.025 0.025
Na2-EDTA 37.3 37.26
ZnNa2-EDTA
Ferric chloride • 6H2O
Ferric citrate
Ferric sulfate 2.5
Ferric tartrate • 2H2O
Ferrous sulfate • 7H2O 27.8 27.8
Magnesium sulfate 122.09 180.7 360
Manganese chloride • 4H2O
Manganese sulfate • H2O 10 16.9 5.04
Molybdenum trioxide
Molybdic acid (sodium salt)
• 2H2O
0.25 0.25
Nickel chloride • 6H2O
Nickel sulfate • 6H2O
Potassium chloride 65
Potassium iodide 0.75 0.83 0.75
Potassium nitrate 2500 1900 80
Potassium phosphate
monobasic
170
Potassium sulfate
Sodium nitrate
Sodium phosphate
monobasic
130.5 16.5
Sodium sulfate 200
Zinc nitrate • 6H2O
Zinc sulfate • 7H2O 2 8.6 2.67
Preparación de Soluciones Stock del Medio Base Murashige & Skoog, 1962
Stock A (100X) pesar
KNO3 Nitrato de Potasio 19 g/L
CaCl2.2H2O Cloruro de calcio dihidrato 4.4 g/L
KH2PO4 Fosfato de Potasio monobásico 1.7g/L
NH4NO3 Nitrato de amonio 16.5g/L
Stock A2 10 ml
Stock A3 0.2 ml
Completar a 1000 ml
Stock A2 Pesar
KI Ioduro de Potasio 0.083g
H3BO3 Ácido bórico 0.62g
MnSO4.4H2O Sulfato de Manganeso 4 aguas 1.68g
ZnSO4.7H2O Sulfato de Zinc heptahidrato 0.86g
Na2MoO4.2H2O Molibdato de Sodio. 2 aguas 0.025g
Completar a 100 ml con agua destilada
Stock A3
Pesar y usar Stocks
CuSO4.5H2O Sulfato de cobre 5 aguas
1.5 g
CoCl2.6H2O Cloruro de Cobalto hexahidrato
1.5g
Completar a 1000 ml con agua destilada
STOCK B Pesar
MgSO4.7H2O
Sulfato de Magnesio
heptahidrato 3.7g
Completar a 100 ml con agua destilada
STOCK C Pesar
FeSO4.7H2O
Sulfato de Hierro
heptahidrato 0.55g
*disolver separado en 20
ml
Na2EDTA.2H2O
Sodium Edta.
Dihidrato 0.75g
*disolver separado en
caliente(20ml)
Llevar a 100 ml
Preparación de 1 lt de Medio de cultivo
En 500 ml de Agua destilada agregar:
Stock A 100 ml
Stock B 10 ml
Stock C 5 ml
Azúcar 25g
Adicionar Vitaminas, y Hormonas de acuerdo a formula.
Completar a 1 Litro con agua destilada
· Medir el pH según los valores indicados en la formula. (5.5 hasta 5.9)
· (Elevar el pHcon 1N KOH, bajar con 1N HCl)
· Agregar el Agar en concentraciones adecuadas de acuerdo al tipo de agar.
· Calentar la solución, hasta que se disuelva el agar, Dispensar en los frascos y esterilizar en la
autoclave 121°C y 15 libras de presión, por 15 a 20 minutos.
· Dejar enfriar los medios, dejar al menos un día antes de utilizarlos.
PRÁCTICAS DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE PARA LOS MEDIOS DE CULTIVO
1. INTRODUCCIÓN
Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro":
- Sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como
macronutrientes
- Vitaminas tales como Riboflavina, tiamina, piridoxina, ácido nicotínico, ácido pantoténico,
biotina, y ácido fólico.
- Aminoácidos tales como L-glutamina, asparragina y cisteína
- Hexitoles como mio-inositol
- Hormonas y reguladores del crecimiento
- Fuente de carbono
- Agente gelificante
- ...
Un método de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como
"soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentración que
suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentración final del medio. Su ventaja no
estriba sólo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino
también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están tan diluidos en la solución final,
que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las balanzas de
precisión.
Las soluciones madre se conservan en frigorífico y en bote topacio durante algunos meses,
desechándose ante cualquier señal de precipitación.
Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos, hormonas, vitaminas y
hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se
necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bién en solución.
En el caso de las hormonas es mejor preparar una solución madre de cada una de ellas y medir
volúmenes determinados y congelarlos en un frigorífico de 4 estrellas.
2. OBJETIVO.
Preparar soluciones madre necesarias para la composición de los medios de cultivo que se emplearán
en el conjunto de las prácticas de la asignatura.
3. MATERIAL
Botes de cristal o de plástico (preferiblemente de los primeros por su transparencia), que en
algunos casos habrán de ser de color topacio para proteger de la luz determinados compuestos
que son fotosensibles
Granatario
Balanza de precisión
Espátulas de distinto tamaño para pesar
Embudos de pesar
Agitador magnético
Imanes
Vasos de precipitados
Probetas
Matraces aforados
Eppendorf
Compuestos químicos
Agua destilada
4. METODOLOGÍA
Se prepararán soluciones madre de las sales minerales, vitaminas, aminoácidos y hormonas necesarias
para los medios DKW y MS. Veamos la composición de cada uno de ellos:
Sales mineralesMS (Murashige and Skoog, 1962) (gL-1)
(NH4 )NO3 1.650
KNO3 1.900
CaCl2.2H2O 0.440
MgSO4.7H2O 0.370
KH2PO4 0.170
FeSO4.7H2O 0.0278
Na2EDTA. 2H2O 0.0372
MnSO4.H2O 0.0169
ZnSO4.7H2O 0.0086
H3BO3 0.0062
KI 0.00083
Na2MoO4.2H2O 0.00025
CuSO4.5H2O 0.000025
CoCl2.6H2O 0.000025
Mioinositol 0.100
Tiamina HCl 0.0001
Acido nicotínico 0.0005
Piridoxina HCl 0.0005
Glicina 0.002
Sales minerales DKW modificado (g/L-1)
(NH4)NO3 1.416
Ca (NO3)2 3H2O 1.811 (1.960 si es 4 H2O)
CaCl2 2H2O 0.147
MgSO4 7H2O 0.74
KH2PO4 0.258
FeSO4 7H2O 0.00676
Na2 EDTA 2H2O 0.0908
K2SO4 1.56
Mn SO4 H2O 0.0338
Zn SO4 7H2O 0.0212
BO3H3 0.0124
KI 0.00166
Na2MoO4 2H2O 0.0005
Cu SO4 5H2O 0.00005
Co Cl2 6H2O 0.00005
Mioinositol 0.1
Tiamina H Cl 0.001
Ác. nicotínico 0.001
Piridoxina. HCl 0.001
Biotina D(+) 0.00001
Glutamina (base libre ) 0.001
L-Cysteína H Cl 0.001
Pantotenato de Ca 0.1
Lo más normal es preparar soluciones que contengan varios componentes, de modo que la
preparación de la solución final sea más rápida y tenga menos margen de error.
Veamos la composición de cada una de las soluciones madre de ambos medios
SOLUCIONES MADRE DEL MEDIO MS (gL-1)
MACRONUTRIENTES (10 X)
NH4NO3 16.5
KNO3 19
MgSO4.7H2O 3.7
KH2PO4 1.7
CALCIO (10 X) gL-1)
CaCl2.2H2O 4.4
MICRONUTRIENTES (100 X)
MnSO4.H2O 1.69
ZnSO4.7H2O 0.86
H3BO3 0.62
KI 0.083
Na2MoO4.2H2O 0.025
CuSO4.5H2O 0.0025
CoCl2.6H2O 0.0025
HIERRO Y EDTA (10 X)
FeSO4.7H2O 0.278
Na2EDTA.2H2O 0.372
VITAMINAS (20 X)
Mioinositol 2
Tiamina HCl 0.002
Acido nicotínico 0.01
Piridoxina HCl 0.01
Glicina 0.04
SOLUCIONES MADRE DEL MEDIO DKW MODIFICADO (g/L-1)
A (10 X)
NH4NO3 14.16
CaCl2 2 H2O 1.47
Ca (NO3)2 3 H2O 18.11 ( 19.60 g/l si es 4 H2O )
B (10 X)
KH2PO4 2.58
C(10 X)
K2SO4 15.6
D (10 X)
Mg SO4 7 H2O 7.4
E (50 X)
Mn SO4 7H2O 1.69
Zn SO4 7H2O 1.06
BO3H3 0.6.2
KI 0.083
Na2MoO4 2H2O 0.025
Cu SO4 5 H2O 0.0025
Co Cl2 6H2O 0.0025
F1 (100 X)
Glutamina (base libre ) 0.1
L-Cisteína HCl 0.1
F2 (100 X)
Biotina D(+) 0.001
Tiamina H Cl 0.1
Ác. Nicotínico 0.1
Piridoxina 0.1
Pantotenato de Ca 0.1
G (10 X)
Mioinositol 1
H (10 X)
Fe SO4 7H2O 0.338
Na2 EDTA 2H2O 0.454
Hormonas (1000 X)
BAP 1
IBA 1
Establecer ocho equipos de trabajo por cada grupo de prácticas (dos en cada lateral de una mesa).
Normas generales a la hora de pesar
- Comprobar los cálculos. Y tener en cuenta que los valores de las soluciones madre están
expresados para un litro
- Leer las características del reactivo que se va a pesar. Algunos son tóxicos por inhalación o en
contacto con la piel y hay que mantener las debidas precauciones.
- Desde 0.01 g se utilizará el granatario. Para valores inferiores la balanza de precisión.
- Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se está haciendo la pesada. Nunca se debe
pesar directamente sobre el platillo de la balanza.
- Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que
esté limpia y seca. Es una precaución que evita la contaminación de los reactivos
- Hay que tener la precaución de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo
que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tomó.
Normas generales a la hora de preparar las disoluciones
- Si la disolución se va a remover con un agitador mecánico el mejor recipiente es un vaso de
precipitados. Si la agitación es manual, suele ser mejor un erlenmeyer.
- Antes de empezar a añadir los solutos se deberá poner un 70% del volumen total de agua
- Cuando una disolución incluya más de un reactivo, estos se añadirán uno a uno y teniendo
la precaución de no añadir uno hasta que el otro esté totalmente disuelto.
- Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de
precipitados o un erlenmeyer.
- Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren
los siguientes datos:
- Tipo de solución. Ej. Macro de MS, sol A de DKW etc
- Grado de concentración. Ej 100 X (100 veces más concentrada que la solución final)
- Componentes con fórmula y peso en g/l
- Fecha de preparación
Equipo 1 Preparará 250 ml de la solución de macronutrientes del medio MS.
Equipo 2 Preparará 250 ml de la solución de Calcio MS y 250 ml de la solución de Hierro y EDTA
MS. En este segundo caso, se deberá poner en el recipiente donde se prepara la disolución un
volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y adicionar la solución de hierro.
Cuando se haya disuelto, adicionar poco a poco y en agitación las sales de EDTA hasta su total
disolución. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolución. Guardar en frasco topacio
en el frigorífico
Equipo 3 Preparará 250 ml de la solución de micronutrientes del medio MS
Equipo 4 Preparará 250 ml de la solución de vitaminas del medio MS
Equipo 5 Preparará 250 ml de de cada una de las siguientes soluciones A ,B, C y D del medio DKW
Equipo 6 Preparará 250 ml de cada una de las siguientes soluciones: F1, G, H y las hormonas del
medio DKW.
- La solución H se prepara del siguiente modo: se pone en el recipiente donde se prepara la
disolución un volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y se adiciona la sal de
hierro. Cuando se haya disuelto, se adicionan poco a poco y en agitación las sales de EDTA
hasta su total disolución. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolución. Guardar en
frasco topacio en el frigorífico
- Hormonas. Se prepararán 10 ml de cada una de las disoluciones. Para cada una de ellas se
procederá del siguiente modo: Se pesará la hormona en el un tubo aforado. Se le añaden
unas gotas de NaOH 1N y se disuelve. A continuación se va añadiendo poco a poco y
agitando, agua destilada hasta enrasar los 10 ml. Se agita bien y se reparte en 10 eppendorf.
Se rotulan cada uno de ellos y se guardan en el congelador.
Equipo 7 Preparará 250 ml de la solución E
Equipo 8 Preparará 250 ml de la solución F2. Primero se preparan 500 ml de la solución de biotina.
De estos 500 ml, se toman 250ml y se les añade la cantidad correspondiente a 250 ml del
resto de las vitaminas.
5. BIBLIOGRAFÍA
Álvarez Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de prácticas de
Biotecnología Vegetal. Universidad de Extremadura (Badajoz)
Driver, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. Hort.
Science, 19(4).
Murashige, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiología Plantarum, 15, 473-497.
Revilla Bahillo, Ángeles y Ordás, Ricardo. Guiones de prácticas de Biotecnología Vegetal.
Universidad de Oviedo
PREPARACIÓN DE MEDIO NUTRITIVO PARA EL CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOSVEGETALES
http://ccagro.uaa.mx/cca/material/AG/S04/M/AGM24S04.pdf
Introducción
Para mantener la viabilidad de un cultivo de tejidos, estimular su diferenciación y guiar su
crecimiento, éste requerirá de una dieta balanceada de nutrientes y hormonas.
Los medios de cultivo son combinaciones de sustancias químicas que los investigadores han descrito
después de numerosos experimentos y que permiten que las plantas crezcan y se multipliquen in vitro.
Los ingredientes de un medio de cultivo vegetal pueden clasificarse en: 1) sales inorgánicas
(minerales), 2) compuestos orgánicos, 3) preparaciones naturales complejas y 4) materiales inertes.
I. SALES INORGANICAS
Los esfuerzos realizados para optimizar las necesidades de plantas específicas, han dado como resultado
numerosas fórmulas de mezclas de sales. Sin embargo, los elementos mayores esenciales que todas las
plantas requieren y que están presentes en los fertilizantes comunes, también forman parte de los
medios de cultivo: Nitrógeno (N), Fósforo (P), Potasio (K), Azufre (S), Calcio (Ca), Magnesio (Mg)
y Hierro (Fe).
Además de los elementos menores, que también son esenciales pero que se requiere en cantidades
extremadamente pequeñas: Boro (B), Molibdeno (Mo), Manganeso (Mn), Cobalto (Co), Zinc (Zn),
Cobre (Cu), Cloro (Cl) y Yodo (I).
Una de las mezclas de sales más usadas es la descrita por Murashige y Skoog. Esta es conocida como
fórmula MS.
II. COMPUESTOS ORGANICOS
En esta categoría se encuentran sustancias como carbohidratos, hormonas o reguladores de
crecimiento, vitaminas y algunos otros compuestos que se han descrito como beneficiosos para el
cultivo de tejidos: aminoácidos, amidas, purinas y pirimidinas y ácidos orgánicos.
- Los carbohidratos: son sustancias orgánicas como los azúcares que proveen tres de los elementos
mayores esenciales: Hidrógeno (H), Carbono (C) y Oxígeno (O).
Los azúcares son producto de la fotosíntesis, proceso por medio del cual la planta convierte el dióxido
de carbono y agua en carbohidratos con la ayuda de la clorofila y la luz. Sin embargo, las plantas que
crecen in vitro, debido a la baja intensidad lumínica, no pueden fabricar todo el azúcar que requieren,
por lo que se adicionan altas concentraciones de sacarosa al medio de cultivo.
- Hormonas: las sustancias hormonales críticas en el cultivo de tejidos son las auxinas y las
citoquininas. Estas intervienen en la elongación y división celular, formación de brotes y raíces y en la
germinación de las semillas.
Entre las auxinas más utilizadas en el cultivo de tejidos se encuentra: ácido indolacético (AIA), ácido
naftalenacético (ANA), 2,4-D, picloram. Entre las citoquininas se encuentra: benzilaminopurina
(BA), la kinetina y zeatina.
Las giberelinas y el ácido abscísico son también utilizadas en algunos casos.
- Vitaminas: la vitamina que se ha demostrado consistentemente como importante en el cultivo de
tejidos es la tiamina. Sin embargo, otras han sido utilizadas con frecuencia por estimular procesos
específicos: biotina, ácido nicotínico, piridoxina, pantolenato, riboflavina. - Aminoácidos: entre los
aminoácidos y amidas que se han mostrado más frecuentemente como beneficiosos está L-arginina,
L-ácido aspartico, L-glutamina, L-ácido glutámico y L-tirosina.
Otros compuestos orgánicos comúnmente empleados en el cultivo de tejidos son el inositol, adenina,
sulfato de adenina, el ácido cítrico y el ascórbico (para evitar la oxidación de los tejidos).
III. PREPARACIONES NATURALES COMPLEJAS
Una gran variedad de sustancias de composición indefinida han sido utilizadas para enriquecer los
medios de cultivo. Entre ellas se menciona: extracto de malta, agua de coco, extracto de levadura,
pulpa de banano, caseína hidrolizada y jugo de naranja y tomate
IV. MATERIALES INERTES
- Geles húmedos que actúan como agentes de soporte: agar, gelrite, fitagel.
- Carbón activado que en bajas concentraciones contrarresta efectos negativos que producen algunas
sustancias liberadas al medio por el cultivo (fenoles).
FORMULACION DE SALES DE ORMULACION MURASHIGE Y SKOOG
Debido a que ésta fórmula es frecuentemente usada en la micropropagación de un gran número de
especies vegetales, se describe a continuación:
Macroelementos Compuestos mg/L
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2.2H2O 440
MgSO4.7H2 O 370
KH2PO4 170
Microelementos
H3BO3 6.2
MnSO4.H2O 16.8
ZnSO4.7H2O 8.6
KI 0.83
Na2MoO4.2H2O 0.25
CuSO4.5H2O 0.025
CoCl2.6H2O 0.025
Hierro
Na2EDTA 37.3
FeSO4.7H2O 27.8
Propósito específico de la práctica
Preparación de un medio nutritivo básico sin fitorreguladores útil para la siembra explantes y el
crecimiento de plántulas asépticas a partir de semillas in vitro
Criterios de desempeño
Como profesional en formación serás competente para Preparar un medio nutritivo básico sin
fitorreguladores útil para la siembra explantes y el crecimiento de plántulas asépticas a partir de
semillas in vitro cuando:
RRTengas el conocimiento teórico acerca de los nutrientes esenciales que requieren las plantas para
vivir.
RRTengas los reactivos apropiados y las soluciones “madre” preparadas con anticipación.
Resultados esperados.
Que prepares un litro de medio nutritivo según la formula de Murashigue y Skoog (1963)
Normas de seguridad específicas de la práctica.
Cuadro de Detección de Riesgos particulares de la práctica
…
Tipo de
peligro
Como evitarlo Como proceder en caso de un accidente
Quemaduras
por
contacto con
el
autoclave
Utilizar
guantes de
asbesto
al manipular la
tapa
Cubrir la zona afectada inmediatamente con un trapo humedecido.
Si la quemadura es leve, untar una porción de pomada para
quemaduras. En caso grave acudir con el medico
Momento Actividad Duración (horas)
1 Preparar soluciones “madre” 2
2 Pesar y agregar soluciones según la formula 0.5
3 Fundir el agar y agregar el medio a los recipientes
De cultivo, esterilizar
1.5
b) Dinámica
Se explicará con detalle el procedimiento de preparación de los medios de cultivo, de manera que el
estudiante que se inicia en el área del cultivo de tejidos encuentre aquí una guía. Debe tener en cuenta
que existen en el mercado fórmulas completas listas para su uso que podrán usarse cuando el proceso
es rutinario, sin embargo, éstas son más costosas.
Debido a que el medio de cultivo es uno de los factores más importantes en el éxito del proceso es
importante trabajar con cuidado y despacio al principio para poder anticipar las consecuencias de cada
acción y familiarizarse con el equipo, cristalería, etc.
Preparación de las soluciones madre:
Por lo general, la preparación del medio de cultivo se inicia preparando soluciones concentradas
(madre) de uno o más compuestos. Determinado volumen de cada una de estas soluciones se
mezclará más tarde para preparar el medio de cultivo final.
Es recomendable preparar las soluciones madre en cantidades relativamente altas y con antelación para
ahorrar el tiempo y el trabajo que implica pesar cada uno de los ingredientes cada vez que se prepara
un medio de cultivo. Además, como muchos de los componentes (microelementos, vitaminas,
hormonas) son requeridos en pequeñas cantidades, si se multiplica esa cantidad por un determinado
número de veces para preparar la solución madre, la labor de pesado será más fácil y más precisa.
La concentración de la solución madre debe ser un factor a considerar. Soluciones madre muy
concentradas tienden a formar precipitados. En algunos casos estos precipitados son el resultado de
mezclar sustancias incompatibles, por ejemplo, calcio y fosfato o sulfato, magnesio y fosfato. Es
recomendable que la solución madre no sea mayor de 100 veces (100X) la concentración final del
medio, sin embargo, el volumen de medio a preparar por semana en el laboratorio dará la pauta para
considerar el grado de concentración de la solución madre. Si la solución madre presenta precipitados
es mejor descartarla ya que no poseerá el balance adecuado de sustancias, alguna proporción de éstas
estará en el fondo con el precipitado. La calidad del agua:
Otro punto importante de tener en cuenta es el uso de agua desionizada (desmineralizada), destilada
o bidestilada para la preparación de los medios de cultivo.
- Almacenamiento de las soluciones madre:
Las soluciones madre deben almacenarse en el refrigerador. No se puede dar un dato exacto de cuanto
tiempo pueden permanecer almacenadas sin que sufran deterioro, pero como regla general, los
compuestos inorgánicos son más estables que los orgánicos, por lo que se ha recomendado almacenar
auxinas y citocininas por un máximo de 2 semanas y los otros componentes por 2 meses, sin
embargo, si se observa un precipitado la solución debe descartarse inmediatamente.
Con un ejemplo se explicará como se prepara una solución madre (50X) tomando como base la
fórmula de sales minerales de Murashige y Skoog.
Preparación de los macroelementos y microelementos:
NH4NO3 la fórmula indica 1650 mg/l en el medio de cultivo, por lo tanto, para preparar una solución
50X (50 veces más concentrada, que será suficiente para preparar 50 litros de medio de cultivo)
multiplique 1650 mg x 50 = 82500 mg (82.5 g). De la misma manera multiplique la cantidad
indicada para cada uno de los otros macroelementos. En un matraz aforado de 1 litro que contenga
aproximadamente 500 ml de agua destilada agregue las cantidades pesadas de cada uno de los
macroelementos, agite y llene el matraz con agua hasta la marca de aforo. Vuelque el matraz de
manera que quede una burbuja en el fondo y agite varias veces. Repita unas dos veces. Transfiera la
solución de macroelementos a una botella para su almacenamiento en el refrigerador. Etiquete la
botella. No olvide escribir la fórmula que usó (Macro MS), concentración (50X), fecha, nombre de la
persona que los preparó.
Para recordar la cantidad a agregar por litro de medio de cultivo a preparar recuerde dividir 1000
ml/50 = 20 ml de la solución madre/l litro de medio de cultivo. Repita la operación pero con los
microelementos.
Preparación del Hierro:
Para preparar la solución madre de hierro, ponga a hervir aproximadamente 700 ml de agua
bidestilada (destilada o desionizada dependiendo de las facilidades con que disponga) en un
erlenmeyer de 1000 ml, cuando está hirviendo agregue la cantidad pesada de Na2EDTA y
FeSO4.7H2O (recuerde que está preparando una solución madre 50X, por lo tanto, multiplique la
cantidad indicada en la fórmula por 50) hasta que desarrolle color.
Tápela y déjela enfriar en un lugar oscuro. Cuando esté a la temperatura ambiente transfiérala a un
matraz aforado y agregue agua hasta la marca de aforo.
Almacena en el refrigerador en una botella ámbar para evitar la foto descomposición. Si no dispone
de botella ámbar forre una botella con papel aluminio. Identifíquela.
PROCEDIMIENTO: Preparación de medio MS para el cultivo in vitro de tejidos vegetales.
1. Utiliza un recipiente cuyo volumen sea dos veces mayor que el final a preparar, agregue agua
destilada hasta completar aproximadamente el 90% de dicho volumen final. Por ejemplo, para
preparar 1 litro de medio se agregarán 900 ml de agua.
2. Pesa y agrega cada uno de los siguientes compuestos, agitando suavemente hasta disolver.
NH4NO3 1.650 g
KNO3 1.900 g
MgSO4.7H2O 0.370 g
KH2PO4 0.170 g
CaCl2.2H2O 0.440 g
3. Selecciona una pipeta de graduación adecuada, para cada uno de las siguientes soluciones
concentradas tome el volumen indicado y agrégelo al recipiente mientras agita suavemente.
Sol. A 1.0 ml
Sol. B 1.0 ml
Sol. C 1.0 ml
Sol. FeEDTA 10 ml
Sol. Vitaminas 5 ml
4. Pesar y agrega la sacarosa (30g/L) y cualquier otro compuesto orgánico que se desee (ej.
Reguladores vegetales).
5. Mientras agitas continuamente, ajusta el pH en un valor deseado (ej. 5.7). Para aumentar el valor
agrega algunas gotas de NaOH y para disminuirlo agrega HCl 0.1N respectivamente.
6. Pesa y agrega el gelificante (ej. 2.0 g/L de Fitagel.
7. Agrega agua destilada adicional hasta completar el volumen final deseado.
8. Calienta la solución a 108ºC aproximadamente hasta que la turbidez del gelificante se clarifique.
9. Vacía con cuidado el medio en los recipientes o frascos de cultivo y coloque las tapas.
10. Coloca los frascos de modo ordenado dentro de la autoclave y esteriliza durante 15 min. A 121ºC .
Sistema de evaluación
La evaluación se basa en la asistencia obligatoria a la práctica y en la entrega individual de un reporte
escrito que deberá cumplir con las recomendaciones generales que en este manual se proponen
(Anexo 1)
El medio que prepares deberá mantenerse semisólido y estéril después de una semana y se utilizará
para la práctica siguiente
Contesta el siguiente cuestionario:
1. Describe las funciones que cada uno de los siguientes elementos y compuestos desempeñan dentro
de las plantas.:Nitrógeno, Fósforo, Potasio. Calcio, Azufre, Magnesio, Fierro, Manganeso, Cobre,
Zinc,Molibdeno, Boro, Cloro, Glicina, Piridoxina, Tiamina, Myo-inositol, Ac. nicotínico, Biotina, Ac
pantoténico.
2. Investiga las fórmulas de al menos tres tipos de medios nutritivos diferentes al MS (Murashige and
Skoog).
3. Explica los mecanismos de cotransporte (simporte y antiporte) mediante los cuales, tanto aniones
como cationes nutrientes entran a la célula a través de la membrana plasmática y del tonoplasto.
4. En el cultivo de tejidos la mayoría de las veces los explantes son secciones de tejidos carentes de un
órgano especializado en la absorción de agua y nutrientes (raíz). Explique ¿cómo estos tejidos pueden
incorporar dichos nutrientes y mediante cuáles rutas pueden transportarlos?
5. ¿Qué diferencia presenta la nutrición hidropónica e in vitro en comparación con la nutrición en
suelo, en relación con la disponibilidad de los nutrientes minerales?
BIBLIOGRAFÍA
Roca, W.M. y Mroginsky, L.A. 1991 Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y
aplicaciones. CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical). Colombia.
Torres K.C. 1989 Tissue Culture Techniques for horticultural crops. Van Nostrand Reinhold.
Pierik R.L.M. 1990 Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ed. Mundi Prensa
Perez.-Molphe B.E.M., Ramírez, M., Niñez, P.H.G. y Malagón R.P. 1999 Introducción al
cultivo de tejidos vegetales.
Taiz, L. and Zeiger, E. 1998. Plant Physiology 2nd edition. The Benjamin/Cummings
Publishing Company. Inc.